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關于小鼠肝組織DNA的提取

更新時間:2013-01-11 點擊量:3311

實驗原理
    真核生物
DNA主要以核蛋白形式存在于細胞核中,因此制備DNA必須先粉碎組織,裂解細胞膜和核膜,使核蛋白釋放,在除去蛋白質、脂類、糖類和 RNA等物質,得到純化的DNA。在本實驗的提取DNA反應體系中,SDS(十二烷基磺酸鈉)破壞細胞膜和核膜,并使蛋白質變性,將核蛋白中的DNA與蛋白質分開,EDTA及SDS抑制細胞中的DNA酶的活性。用酚、氯仿抽提的方法進一步除去蛋白質,得到的DNA溶液經乙醇沉淀除凈小分子化合物。提取出的 DNA制品進一步用含溴乙錠的瓊脂糖凝膠電泳加以鑒定。
主要試劑
1. 生理鹽水
2. 裂解緩沖液
3. 苯     酚:氯       仿混合液(1:1)
4. 無水乙醇
5. 70%乙醇
6. TE緩沖液
7. 溴酚藍載樣液
8. 溴乙錠溶液
9. TBE緩沖液
主要設備
1. 研缽
2. 研缽棒
3. 刻度離心管
4. 普通離心機
5. 小試管
6. Ep管
實驗材料
小鼠
實驗步驟
1. 處死小鼠,迅速取出小鼠肝臟,用生理鹽水洗去附著血液,用濾紙吸干血水后稱量0.5g肝實質組織放于研缽中。
2. 研缽中加入1ml裂解緩沖液、少量石英砂,研磨至勻漿,再加入2ml繼續研磨至勻漿。
3. 取刻度離心管一支,加肝勻漿至1.0ml,再加入等體積苯酚:氯仿混合液抽提,每次抽提以中等大小的力來回振蕩5min,然后離心 3000r/min,10min,水相吸入另一干凈的小試管中,抽提重復3次。
4. 往乘有上水相的小試管中加入2.5倍體積的冷無水乙醇,輕輕混勻,此時可見有白色絮狀沉淀,此即DNA粗制品。
5. 將試管中的上清液倒出,保留沉淀。用70%的乙醇洗滌沉淀2次,洗滌時動作要輕柔,同上法棄上清保留沉淀。
6. 加入0.25mlTE緩沖液溶解沉淀。
7. 取30ml沉淀溶解液放入Ep管中。
8. 向Ep管中加入溴酚藍載樣液5ml,混勻后即為鑒定所用樣品。
9. 取瓊脂糖0.3g,TBE緩沖液15ml加入錐形瓶中,加熱錐形瓶使瓊脂糖充分熔解后,加入10ml溴乙錠,混勻后將膠液倒入已放置樣孔梳的膠板上。
10. 待膠板凝好后拔去樣孔梳,取15ml樣品液加入樣孔槽中。
11. 將加好樣品液的膠板放入乘有TBE緩沖液的電泳槽中,樣孔槽位于陰極側,蓋好電泳槽蓋后通電,調節電壓100V電泳40-60min。
12. 泳畢,拿出膠板,在紫外光燈下觀察結果。
注意事項
1. 吸水相時不要將界面上的變性蛋白質混入,抽提3次后一般有機相和水相界面上的變性蛋白質極少,肉眼基本看不見,若變性蛋白質仍較多,可增加抽提次數。實驗中使用的吸取DNA水溶液的滴管管口需粗而短,并燒成鈍口。
2. zui后一次棄上清時,盡可能去盡上清。

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